Speaker
Description
Analýza buněčného cyklu průtokovou cytometrií se běžně používá pro stanovení obsahu buněčné DNA v experimentálním výzkumu, klinickém výzkumu a diagnostice. V klinických laboratořích jsou touto technikou identifikovány aneuploidní rakovinné buňky, ve výzkumu se této analýzy využívá pro měření buněčné proliferace, apoptózy, a zjišťování vlivu biologických, chemických i fyzikálních vlivů na buněčné linie. Standardně se pro fixaci buněk používá etanol, po kterém následuje štěpení RNA a interkalace propidium jodidu do DNA. Tato metoda je však časově náročná, obsahuje několik promývacích kroků a v neposlední řadě vyžaduje oddělení adherentních buněk od kultivačního plastu. V našem zjednodušeném protokolu využíváme dobře dostupnou sadu BD Cycletest Plus DNA Kit, která byla navržena pro kvantifikaci buněčného cyklu a kvalifikaci aneuploidie v klinických vzorcích. Radiační poškození buněk bylo sledováno v rámci experimentu, ve kterém jsme využili dvou typů HeLa buněk – standardní linie a linie s knockoutovaným proteinem BBC3. Tyto linie byly nasazeny do kultivačních destiček 24 hodin před ozářením. Následně byly vystaveny ionizujícímu gama záření 60Co (Chisotron, Chirana, Česká republika) v dávce buď 2 Gy nebo 10 Gy, kultivovány přes noc a zpracovány pro měření obsahu DNA (klasickou etanolovou fixací a BD Cycletest Plus DNA Kitem). Na základě porovnání G0/G1, S a G2/M fází buněčného cyklu bylo možné od sebe odlišit normální HeLa a radioresistentnější knockout BBC3 HeLa buňky klasickým prokolem i kitem, avšak použití kitu umožnilo reprezentativní analýzu menšího počtu buněk v rychlejším čase. Speciální poděkování patří panu Jiřímu Šinkorovi (Life Sciences, Becton Dickinson Czechia, s.r.o.) za nepostradatelnou aplikační podporu ve všech fázích experimentu. Práce byla podpořena Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy ČR (SV/VLF202401) a Ministerstvem obrany ČR (DZRO-FVZ22-ZHN II).
